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中空纤维切向流过滤:高效纯化无脊椎血红蛋白

作者:瑞普利金(上海)生物科技有限公司 2014-01-10T00:00 (访问量:2088)

中空纤维切向流过滤:高效纯化无脊椎血红蛋白

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简介


输血是临床上最常使用的治疗手段之一,但其常面临季节性短缺以及特殊血型献血不足等问题,在缺乏特定检测及储存设备的欠发达地区,该问题尤为严重。为解决输血制品的经济、安全及供应问题,近年来,科学家开始关注于血红蛋白氧载体(HBOC)的开发。传统的HBOC来源主要为哺乳动物,虽具有极大临床潜力,但在制备过程中,不可避免地出现诸多副反应,如血红蛋白(Hb)四聚体解聚,从而渗出血管或肾小管壁,引起组织或肾脏毒性;又或Hb被氧化,失去携氧能力;纯化的Hb也易受一氧化氮(NO)的影响。


陆生蚯蚓(Lumbricus terrestris)没有红细胞,但含有一种独特的血红蛋白,称为无脊椎动物动物血红蛋白(LtEc),其是由144Hb亚单位和36个交联蛋白组成的大分子,非常稳定,耐氧化,已有实验证明,LtEC可在小鼠及大鼠体内运输O2,而无明显长期副作用,所以被认为可用于替代捐献来源人体红细胞。


LtEc应用的前提是建立安全、高效的制备工艺,曾有实验尝试使用体积排阻层析和超速离心,但收率和规模放大性都差强人意。本文尝试使用切向流过滤(TFF)纯化LtEc,并测试所得产物的纯度、产量、粘度、高铁血红蛋白水平、胶体渗透压、氧结合平衡以及配体结合动力学等参数,并进行仓鼠输血实验,检测了产物的安全性。

 

实验


每批次实验使用2L蚯蚓,漂洗去除泥土和粘液后,均质匀浆,去除固体碎片,上清液再离心后,滤纸过滤,去除较大的颗粒。


初步澄清过滤采用两根并联的0.2μm中空纤维切向流过滤组件(产品编号:M1-M02E-360-F1S;膜表面积:1050cm2;膜材质:PES),得到2L滤液;滤液先用500kD中空纤维切向流过滤组件(产品编号:M2-500S-100-01P;膜表面积:1050cm2;膜材质:PS)浓缩至200ml;回流液再进行10体积洗滤,前8体积使用Tris缓冲液,后2体积改用改良乳酸林格式溶液。洗滤采用间断模式,即先稀释至2L后,再浓缩至200ml。最后1体积洗滤后,回流液浓缩至20-50ml,再用0.22μm针头式滤器除菌过滤。整个切向流过滤工艺流速均稳定为480ml/min


纯化后的样品采用SDS-PAGE分析蛋白浓缩,以*化高铁血红蛋白测定法检测氧化LtEcMetHb)水平,以MALDI-MS分析样品分子量,以血分析仪分析O2平衡曲线和结合/解离动力学,并测试产物粘度和胶体渗透压。


此外,使用仓鼠进行纯化LtEc的超容量输血实验,输血过程监测血浆蛋白浓度,并监测平均动脉血压(MAP)、心率(HR)、功能性毛细血管密度(FCD)、动/静脉血液流速等指标。


结果


SDS-PAGE结果显示,使用0.2μm过滤器进行澄清可去除大分子量的凝血蛋白聚合物等杂质,多次洗滤后,小分子杂质亦可去除,而LtEc被浓缩,且所得产物条带分子量与理论值基本一致。


MALDI-MS结果也证明,所得产物分子量与理论值符合,且无较大杂质峰存在。每批次LtEc的收率为5g左右,且metHb含量极低(~3%)。说明TFF在保证收率的同时,可最大程度地维持LtEc的稳定性。纯化LtEcO2亲和性(P50)与bHb或人全血相似,O2释放常数也无太大差异,而CO结合常数显著较低,也不易受NO攻击。


实验通过仓鼠输血模型检测纯化LtEc的安全性,结果显示,无显著免疫或过敏反应发生,从MAP及血管直径参数看,LtEc不会造成血管紧缩或高血压,反而在较高血浆浓度条件下,血管会轻微舒张。LtEc不会引起HR降低,升高浓度后,动脉血液流速加快,此外,一定浓度的LtEc可增加FCD,说明其可纠正失血性休克时的毛细血管塌陷问题。

 

讨论

 

TFF纯化工艺可用于制备高纯度的完整LtEc,且纯化的LtEc可有效结合并释放O2,其O2亲和性与人体全血相近,而不易受CO攻击,表明其是高效的体内O2载体。纯化LtEc的粘度和COP也与人体全血接近,这使其在输血治疗出血性休克时,可将液体有效驱入毛细血管,提高循环体积,维持FCD,恢复O2输送。在仓鼠输血实验中,也未观察到高血压、血管紧缩或过敏反应等现象,证实了纯化LtEc的安全性。可见,TFFLtEc纯化的高效手段,可进行进一步的规模放大实验。

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