绝对定量测序热度持高，但是，为什么要做绝对定量测序呢？上期为大家解读了miRNA绝对定量测序的实验原因和实验解决策略（点此查看），今日小编为大家友情解读miRNA绝对定量测序的数据分析，话不多说，进入正题：

前面几篇软文已经提到，之所以要做绝对定量测序（转录组测序or miRNA测序），实验原因在于测序前文库构建过程，不管是转录组文库构建还是miRNA文库构建，均有一步PCR扩增的过程，而此过程由于PCR本身原因产生PCR Duplication，从而使得表达量失真，因此需要通过UMI技术，在后续分析过程消除PCR Duplication产生的测序数据，尽可能还原基因/miRNA表达的真实性。

有的看官可能会讲，即使不通过UMI技术，也可以在后续分析过程实现PCR Duplication的消除！是的，在高通量测序数据分析阶段，确实会做PCR Duplication去除，此时去除的理论依据是在所有相同的reads中只保留一条read，同时假设这些相同reads来自于由同一条cDNA PCR产生的相同扩增产物。具体的做法是通过mapping coordinates方法实现（reads比对到同一个基因组位点，会被认为是相同的reads）。但是这种方法有它的弊端：

1、高通量测序中，来自不同cDNA但是序列一致的reads出现的概率增大，使用mapping coordinates方法或人为丢失阳性数据；

2、对于基因组比较小，或者是基因组子集测序（例如miRNA测序，编码miRNA的区间只占基因组的很小一部分），此种去mapping coordinates导致的后果会更严重，因为序列越短，不同cDNA来源产生相同reads的概率越高；

3、具有相同序列的miRNA成熟体可由不同前体加工，对应不同的基因组位点，因此使用mapping coordinates方法会忽略掉此信息。

总结一下，常规mapping coordinates方法会导致真实的数据被错误的去除，造成数据的失真。所以，我们需要UMI技术克服这种问题。下面我们通过一些数据来展示UMI技术和mapping coordinates方法技术相比，在转录组测序和miRNA测序中去除PCR Duplication的优势。

表1：转录组测序两种PCR Duplication方法比较

表2：miRNA测序两种PCR Duplication方法比较

从两个表可以看出，转录组测序中使用mapping coordinates法，16.4–44.5%的reads被认定为PCR Duplication，而UMI方法只有1.89–10.67%被认为是PCR Duplication，高估率达到几百上千倍。而在miRNA测序中，mapping coordinates法认定的PCR Duplication数据极为夸张，达到了56.0–76.8%，实际上使用UMI方法分析得到的PCR Duplication比率只有1.05–13.6%，二者相比最低相差也达到千倍。